دوره آموزشی تکنیک الایزا

(ELISA) مخفف (Enzyme linked immunosorbent) یعنی  روش سنجش ایمنی متصل به آنزیم

تست الایزا یک روش ایمونولوژیک حساس برای تشخیص و اندازه گیری واکنش آنتی ژن ها و آنتی بادی ها است. این روش برای بررسی میزان پروتئین ها، گلیکوپروتئین ها و هورمون ها در نمونه ای از بافت ها، سلول ها یا ترشحات بدن استفاده می شود. اساس این آزمایش اتصال یک آنتی بادی خاص به آنتی ژن مربوطه است. نمونه هایی که معمولا در الایزا استفاده می شوند شامل سرم، پلاسما، مایع رویی کشت سلولی، لیزات بافت و سلول، بزاق و ادرار است.

تست الایزا یکی از پرکاربردترین تکنیک ها در زمینه آزمایشگاهی است و همانطور که از نام آن پیداست آنتی بادی شناسایی به آنزیم متصل می شود. این تکنیک به طور گسترده ای در آزمایشگاه های تحقیقاتی و تشخیص پزشکی استفاده می شود.

برای تهیه ی دوره آموزشی تکنیک الایزا میتوانید همین حالا کلیک کنید

برای مشاوره و یا خرید دوره آموزشی تکنیک الایزا می توانید به شماره 09020077964 در واتساپ پیام دهید

لطفا از تماس با شماره های آزمایشگاه جدا خودداری نمایید.

سرفصل های دوره آموزشی تکنیک الایزا:

• روش های تشخیص آنتی بادی و آنتی ژن
• اصول پایه ای الایزا
• آشنایی با اجزا و موارد مورد استفاده در تکنیک الایزا
• انواع تکنیک الایزا شامل غیر مستقیم ، ساندویچی ، و رقابتی
• مراحل انجام تست الایزا به تفکیک
• روش کار با دستگاه الایزا ریدر
• تعیین متد تست های غلظتی و Cutt of
• تکنیک های سمپلینگ
• تکنیک های اندازه گیری

آزمایش الایزا چیست؟

این شامل هر گونه ایمونواسی فاز جامد پوشش داده شده با آنتی بادی یا آنتی ژن و حضور یک آنزیم درگیر در فرآیند تولید سیگنال است. از آنجایی که یک مولکول آنزیمی می تواند تعداد زیادی مولکول سوبسترا را تبدیل کند، تولید سیگنال بسیار شدید می شود.

انکوباتورها، واشرها و اسپکتروفتومترها در مقیاس آزمایشگاهی یک پلت فرم انعطاف پذیر و ارزان با حساسیت و ویژگی بالا برای تشخیص طیف وسیعی از آنالیت ها ارائه می دهند. توانایی روش الایزا در ارائه تست‌های ارزان و قابل اعتماد برای غربالگری تعداد زیادی نمونه، آن را به روشی مطلوب برای محققانی که با بودجه‌های محدود کار می‌کنند، تبدیل می‌کند. تکنیک الایزا برای شناسایی و تعیین مقدار آنتی ژن ها، آنتی بادی ها، هورمون ها و سایر مولکول ها استفاده می شود.
علاوه بر کاربردها در تشخیص بالینی، از آن به عنوان یک آزمایش اختصاصی برای بسیاری از اهداف تحقیقاتی مانند شناسایی پروتئین ها و داروهای جدید استفاده می شود. معمولاً الایزا در صفحات پلی استایرن 96 انجام می شود.

اساس روش الایزا

آزمایش الایزا به طور کلی در بستری از صفحات پلی استایرن ۹۶ خانه ای انجام می شود. سرم ها در چاهک های صفحه ای انکوبه می شوند که هر چاهک حاوی سرم متفاوتی است. یک سرم به عنوان کنترل مثبت و یک سرم به عنوان کنترل منفی در آزمایش الایزا تعیین می شود. در سطح صفحه هر چاهک، آنتی بادی به آنتی ژن مورد نظر متصل می شود، آنتی بادی ها یا آنتی ژن های موجود در سرم به آنتی ژن یا آنتی بادی مشابه روی سطح متصل می شوند. پس از مدتی، این صفحه با یک سری بافر شسته می شود تا آنتی بادی ها یا آنتی ژن های متصل نشده از بین بروند.

شناسایی آنتی بادی ها یا آنتی ژن های متصل :

برای شناسایی آنتی‌بادی‌ها یا آنتی‌ژن‌های متصل، آنتی‌بادی‌های ثانویه که به یک آنزیم متصل شده یا توسط آنزیمی برچسب‌گذاری شده‌اند، مانند پراکسیداز یا آلکالین فسفاتاز، به هر چاهک اضافه می‌شوند. پس از یک دوره انکوباسیون، آنتی بادی های ثانویه غیر متصل شسته می شوند. هنگامی که یک بستر مناسب به محیط اضافه می شود، آنزیم با آن واکنش می دهد تا یک محصول رنگی و قابل ردیابی تولید کند. این رنگ تولید شده را می توان بر اساس میزان آنتی ژن یا آنتی بادی موجود در نمونه اندازه گیری کرد. شدت رنگ / چگالی نوری در یک طول موج مشخص اندازه گیری می شود. شدت رنگ میزان آنتی ژن یا آنتی بادی را نشان می دهد.

آزمایش الایزا

آزمایش الایزا می تواند بسیار پیچیده باشد و چندین مرحله برای افزودن آنتی بادی ها و آنزیم ها به خصوص هنگام اندازه گیری غلظت پروتئین در نمونه های ناهمگن مانند خون استفاده می شود. پیچیده ترین و متفاوت ترین مرحله در فرآیند کلی آزمایش، مرحله تشخیص است که در آن می توان از چندین لایه آنتی بادی برای تقویت سیگنال استفاده کرد.

مراحل کار تست الایزا در دوره آموزشی تکنیک الایزا به شرح زیر است:

آنتی ژن یا آنتی بادی مکمل آنالیت مورد نظر در کف صفحه رسوب می کند.
سپس نمونه به هر چاه اضافه می شود. پس از افزودن نمونه، شستشو برای حذف آنتی ژن ها یا آنتی بادی های غیر متصل از محیط انجام می شود.
سپس آنتی بادی نشاندار شده با آنزیم اضافه می شود و شستشو تکرار می شود.
مرحله آخر اضافه کردن سوبسترای آنزیمی و دیدن رنگ تولید شده است. صفحه با دستگاه الایزا ریدر خوانده می شود. شدت رنگ تولید شده نشان دهنده غلظت آنالیت مورد نظر است.

مراحل تست تکنیک الایزا در آزمایشگاه در دوره آموزشی تکنیک الایزا:

۱-  مرحله کوتینگ:

شامل کوتینگ آنتی ژن یا آنتی بادی اختصاصی در کف چاهکها است که توسط کارخانه سازنده کیت انجام میشود.

۲- مرحله بلاکینگ :

در این مرحله فضاهای خالی بین آنتی ژنها یا آنتی بادی های کوت شده در کف چاهک، با یک پروتئین خنثی پر میشود.
که توسط تولید کننده کیت انجام میگیرد. آلبومین سری گاوی از رایج‌ترین بلاک کننده ها می‌باشد.

۳- مرحله سمپلینگ :

این مرحله از تست الایزا سرم بیمار و یا معرفهای دیگر نظیر استانداردها و کنترلها، درون چاهکها ریخته میشود.

۴- انکوباسیون :

انکوباسیون به معنای مدت زمان مشخص در درجه حرارت مشخص میباشد. معمولا در دمای ۲۵ یا ۳۷ درجه صورت میگیرد.
در این فرآیند آنتی ژنها و آنتی بادی های موجود در چاهک ها با هم واکنش نشان دهند.

۵- اضافه کردن معرف نشاندار :

این مرحله معرف نشاندار شده با آنزیم که به کانژوگه معروف است به منظور نشاندار کردن واکنشهای آنتی ژن و آنتی بادی افزوده میشود.

۶- شستشو چاهک ها :

در این مرحله با محلول شستشوی کیت، درون چاهک ها شستشو داده میشود.
تا آنتی ژنها و آنتی بادی های غیر اختصاصی که در واکنش شرکت نکرده آمد و OD کاذب ایجاد میکنند، از محیط چاهک ها تخلیه شوند. این مرحله توسط دستگاه الایزا واشر صورت میپذیرد.

۷- اضافه کردن سوبسترا :

در این مرحله از تست الایزا یک معرف دیگر به چاهک ها اضافه میشود که سوبسترا نام دارد.
سوبسترا با کانژوگه واکنش نشان داده و سبب تشکیل رنگ درون چاهک ها میگردد.

۸- اضافه کردن محلول استاپ:

در ادامه تست الایزا یک معرف دیگر به نام Stop به چاهک ها اضافه میشود.

این معرف سبب متوقف کردن واکنش آنزیمی و در نتیجه جلوگیری از افزایش رنگ درون چاهک ها میگردد.

۹- مرحله خوانش:

در این مرحله میزان جذب محتوای چاهک ها به کمک دستگاه الایزا ریدر در طول موج های مشخص اندازه گیری میشود.

انواع تکنیک الایزا در دوره آموزشی تکنیک الایزا :

تست الایزا را می توان با تعدادی تغییر در اصول روش اصلی انجام داد، این تغییرات منجر به ایجاد ۴ روش مختلف تست الایزا می شود که این روش ها شامل موارد زیر است. که تمامی این موارد به طور کامل در دوره آموزشی تکنیک الایزا توضیح داده شده است:

1. ELISA مستقیم در دوره آموزشی تکنیک الایزا
   

2. ELISA غیر مستقیم در دوره آموزشی تکنیک الایزا
   

3.  ELISA ساندویچ در دوره آموزشی تکنیک الایزا
   

4. ELISA رقابتی در دوره آموزشی تکنیک الایزا
   

یک مرحله کلیدی در همه انواع الایزا بی حرکت کردن آنتی ژن مورد نظر است که می تواند با جذب مستقیم به صفحه الایزا یا به طور غیرمستقیم از طریق آنتی بادی چسبیده به صفحه الایزا انجام شود. سپس آنتی ژن به طور مستقیم با آنتی بادی اولیه نشاندار شده با آنزیم یا به طور غیرمستقیم با آنتی بادی ثانویه نشاندار شده با آنزیم شناسایی می شود. آنتی بادی های تشخیص معمولا با آنزیم های آلکالین فسفاتاز (ALP) یا ترب کوهی پراکسیداز (HRP) نشاندار می شوند. بسترهای متنوعی برای انجام ELISA با استفاده از آنزیم های آلکالین فسفاتاز یا ترب کوهی پراکسیداز وجود دارد. انتخاب بستر به حساسیت سنجش مورد نظر و ابزارهای موجود برای تشخیص سیگنال‌های آزمایشی (اسپکتروفتومتر، فلورومتر یا فتومتر) بستگی دارد.

تکنیک الایزا مستقیم در دوره آموزشی تکنیک الایزا:

در این روش آنتی ژن موجود در نمونه مورد شناسایی مستقیماً روی سطح چاهک های صفحه 96 چاهک رسوب می کند و آنتی بادی یا آنتی ژن مکمل آن اضافه می شود. با توجه به برچسب گذاری آنتی بادی متصل به رنگ، آنتی ژن توسط دستگاه میکروپلیت خوان شناسایی می شود.
در الایزا مستقیم، به دلیل عدم اتصال آنتی بادی های غیر اختصاصی به پلیت، از نتایج مثبت کاذب اجتناب می شود. این عدم اتصال به دلیل استفاده از بافرهای مسدود کننده مانند BSA، اووالبومین و آپروتینین است که وظیفه پوشاندن نواحی مختلف چاه های آزمایش را بر عهده دارند. با توجه به حذف واکنش متقاطع آنتی بادی ثانویه و مراحل کمتر در مقایسه با الایزای غیرمستقیم، این روش کاربرد بیشتری دارد. اما به دلیل حساسیت کم و هزینه بالاتر نسبت به سایر انواع الایزا، این روش عموماً در تحقیقات مورد استفاده قرار می گیرد.

تکنیک الایزا غیر مستقیم در دوره آموزشی تکنیک الایزا:

ELISA غیر مستقیم شامل دو مرحله اتصال آنتی بادی اولیه و آنتی بادی ثانویه نشاندار شده است. آنتی بادی اولیه به آنتی ژن های پایین صفحه متصل می شود، سپس آنتی بادی ثانویه به آنتی بادی اولیه متصل می شود. الایزای غیر مستقیم حساسیت بالاتری نسبت به الایزای مستقیم دارد. علاوه بر این، به دلیل استفاده از آنتی بادی های اولیه غیر متصل به ماده کروموژن، امکان استفاده از آنتی بادی اولیه در بسیاری از آزمایشات فراهم شده است که این تکنیک را ارزان تر و انعطاف پذیرتر می کند. تنها مشکل عمده این نوع الایزا ایجاد مثبت کاذب به دلیل واکنش غیر اختصاصی بین آنتی بادی های ثانویه به اجزای دیگر در کف صفحه و عدم شستشو است.

تکنیک الایزا ساندویچ در دوره آموزشی تکنیک الایزا:

به همین دلیل به آن ELISA ساندویچ می گویند زیرا آنتی ژن ها بین دو لایه آنتی بادی قرار می گیرند. تست الایزا ساندویچ بالاترین حساسیت را در بین انواع الایزا دارد. از معایب اصلی این نوع الایزا زمان و هزینه بیشتر نسبت به سایر انواع الایزا می باشد.

تکنیک الایزا رقابتی در دوره آموزشی تکنیک الایزا:

در این نوع الایزا از دو آنتی بادی اختصاصی استفاده می شود، یکی آنتی بادی کونژوگه به ​​آنزیم و دیگری آنتی بادی موجود در سرم مورد آزمایش (در صورت مثبت بودن سرم). ترکیب دو آنتی بادی در چاهک ها امکان رقابت برای اتصال آنتی ژن را فراهم می کند. در صورت تغییر رنگ، نتیجه آزمایش منفی گزارش می شود. این بدان معنی است که آنتی بادی مکمل آنزیمی است که به آنتی ژن (و نه به آنتی بادی های موجود در سرم مورد آزمایش) متصل است. عدم وجود رنگ نشان دهنده مثبت بودن تست (وجود آنتی بادی در سرم مورد آزمایش) است.

برای آنالیز نمونه های رقیق شده نمی توان از الایزای رقابتی استفاده کرد. اما یکی از مزایای این روش بررسی طیف وسیعی از آنتی ژن ها در یک نمونه معین است.